Olá pessoal, tudo bem com vocês?
Em nosso último post falamos sobre o uso da cromatografia acoplada a detectores no intuito de identificar compostos de misturas/extratos naturais.
Abordamos na parte 1 sobre a cromatografia planar que é uma das classificações físicas sobre cromatografia, hoje falaremos sobre a cromatografia de coluna.
A cromatografia em coluna consiste na utilização de colunas de vidro ou metálicas na qual em seu interior será preenchido por adsorvente apropriada, chamada de fase estacionária e específica para cada tipo de análise. Alguns adsorventes amplamente utilizados são a sílica em gel, a alumina, carvão ativado e celulose (1, 2).
Figura 1. Partes de uma coluna cromatográfica. Apresenta uma fase móvel e sistema de entrega – no interior da coluna tem uma fase estacionária que permitirá a discriminação entre o analito da e para fornecer uma taxa de fluxo constante para a coluna; Possui um sistema injetor – para entregar as amostras de teste no topo da coluna de uma maneira reprodutível; Possui um detector e registrador gráfico – o qual apresentará picos que representarão cada analito (composto) da amostra analisada; Apresenta um coletor de frações – que servirá para coletar os analitos separados para posteriores analises. Imagem obtida: (3)
Nesse tipo de cromatografia os analitos podem ser separados pelo tempo de retenção ou pela presença de afinidade com a fase estacionária.
Quanto a eluição das amostras pode apresentar de duas maneiras:
Eluição isocrática – A composição da fase móvel é constante. Por exemplo, GC e algumas formas de HPLC (4).
Eluição do gradiente – A composição da fase móvel (pH, concentração de sal ou polaridade) é alterada continuamente ou de forma gradual para facilitar a separação. Por exemplo, HPLC (4).
Dois processos ocorrem simultaneamente em qualquer separação cromatográfica o qual contribuirá no comportamento do analito e deste modo sua identificação:
1) Processos básicos – adsorção, partição, troca iônica e exclusão molecular. Estes caracterizam a interação de cada analito com a fase estacionária (3)
2) Processos secundários – difusão. Estes se manifestam como um alargamento e redução de cada pico de analito. Este modo acaba resultando em resolução mais pobre (3).
Dentre as cromatografias em colunas as mais comumente utilizada são as que a fase móvel pode ser um liquido (Cromatografia líquida) ou um gás (Cromatografia gasosa).
Cromatografia líquida
A cromatografia líquida pode ser a clássica ou a de alta eficiência.
Cromatografia Líquida clássica
É uma cromatografia em coluna básica na qual o líquido atua como fase móvel e substâncias sólidas inertes como sílica gel, alumina ou celulose apoiados em uma coluna vão atuar como fase estacionária (4)
Para o sucesso da análise é necessário que a fase estacionária esteja saturada com solvente durante a análise por esta técnica. A presença de ar na coluna interromperá o fluxo suave e resultará em separação ineficiente ou incompleta.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A CLAE ou HPLC (High performance liquid chromatography) é uma forma mais aprimorada de cromatografia líquida e uma das técnicas analíticas mais utilizadas tanto na pesquisa quanto na indústria, perícia, etc (5-6).
Na CLAE há a adição de alta pressão para que o eluente flua através da coluna e isso é possível por conta das propriedades físicas das colunas próprias pra CLAE. Por causa disso, o método já foi anteriormente denominado de cromatografia de alta pressão.
Nesta técnica a fase estacionária contém partículas de pequeno tamanho que aumenta a eficiência de separação. Isso ocorre porque o soluto pode se equilibrar mais rapidamente entre as duas fases.
A fase estacionária formada por partículas maiores forma a base da cromatografia líquida de baixa pressão, na qual o fluxo do eluente através da coluna é alimentado pela gravidade ou bombeado por uma bomba peristáltica (bomba de baixa pressão) (5)
Seu custo é mais acessível, no entanto não possui alta resolução. À medida que o tamanho das partículas da fase estacionária diminui, a área de superfície aumenta e, indiretamente, aumenta a resolução (6).
Cromatografia gasosa (CG)
A cromatografia gasosa é um procedimento analítico altamente sofisticado no qual a fase móvel é gasosa. Também separada em dois tipos:
• Cromatografia gás-sólido (fase estacionária é sólida) – atua pelo princípio de adsorção – não está em uso devido ao número limitado de fases estacionárias (3);
• Cromatografia gás-líquido (fase estacionária é o líquido que é fixado ou imobilizado sobre um determinado material de suporte) – atua pelo princípio de partição e adsorção (3);
Os componentes da mistura serão vaporizados e se ligam de maneira fraca ou forte à fase estacionária na coluna. A fase móvel arrastará primeiramente o componente que se ligou de maneira fraca a fase estacionária. Assim, os componentes serão separados de acordo com o ponto de ebulição, peso molecular, polaridade, capacidade de ligação de hidrogênio com a fase estacionária (7).
A pressão parcial do soluto no gás e a sensibilidade do detector à amostra determinam a magnitude da saída. A saída é registrada como a quantidade de soluto que sai da coluna em função do tempo. Para uma análise de CG razoável, o detector precisa ser sensível, operar em alta temperatura (0-400 ° C), estável e garantir reprodutibilidade (7).
Os detectores usados normalmente são: detector de condutividade térmica, detector de emissão atômica, detector termiônico, detector de captura de elétrons, detector fotométrico de chama e detector de ionização de chama (3).
Outras cromatografias….
Cromatografia supercrítica
Usa-se um gás que possui alta difusividade que irá compor a fase móvel, como o dióxido de carbono aplicado na separação de compostos não polares e relativamente hidrofóbicos. Esses gases serão utilizados acima de sua temperatura e pressão críticas (8-9).
Conclusão
O mundo da cromatografia é muito grande e complexo, dentre tudo que foi relatado há muitas variáveis que poderão auxiliar na identificação ideal de determinada mistura. Inúmeras colunas e detectores podem ser usados visando um tipo especifico de analise e amostra.
Existem outros tipos de cromatografia que não foram citados no texto devido a não aplicabilidade de muitas para caracterização química de extratos e identificação destes compostos bioativos.
Vale ressaltar que as técnicas de cromatografia garantem a separação destes compostos os quais só serão identificados com detectores e uso de padrões para obtenção da curva que irá de fato trazer de maneira mais confiável a presença de tal composto, assim como sua possível quantidade no extrato/amostra analisada.
No próximo post, abordaremos o uso de outras formas de identificar os extratos, fiquem de olho e se gostou, compartilha e deixe seu comentário.
Referências
1. COLLINS, C. (2009). Michael Tswett e o “nascimento” da Cromatografia. Scientia Chromatographica, 2009; 1(1): 07-20.
2. Collins, C. H. Cem anos das palavras cromatografia e cromatograma. Química Nova, 2006; 29(4): 889-890.
3. Priyadarshini, Rekha & Marshall Raj, Gerard & Shewade, Deepak. Chromatography – the essence of bioanalysis. European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, 2016; 3: 366-77.
4. CF. Poole. Chromatography Overview. Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering. (2019). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-409547-2.04396-1
5. V. Hebbi, S. Chattopadhyay, & A.S. Rathore. High performance liquid chromatography (HPLC) based direct and simultaneous estimation of excipients in biopharmaceutical products. Journal of Chromatography B. (2019). https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.04.022
6. J. Lozano-Sánchez, I. Borrás-Linares, A. Sass-Kiss, & A. Segura-Carretero. Chromatographic Technique: High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). In Modern Techniques for Food Authentication. (2018). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-814264-6.00013-X
7. C. Cordero, C, C. Cagliero, E. Liberto, B. Sgorbini , P. Rubiolo, & C. Bicchi. Gas chromatography. Chemical Analysis of Food. (2020). https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813266-1.00009-7
8. R. Agrawal, S. Belemkar, & C. Bonde. Supercritical fluid chromatography versus liquid chromatography for the enantiomeric separation of itraconazole. Microchemical Journal. (2020). https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.105320
9. Silva, Carla Grazieli Azevedo da, & Collins, Carol H. Cromatografia de fluido super / subcrítico com colunas empacotadas: estado da arte e aplicações. Química Nova. (2014). https://doi.org/10.5935/0100-4042.20140158
