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Estão acompanhando nossos artigos? Sua visita é muito importante para nós do Biotec2u. Pois bem, hoje falaremos sobre umas das técnicas mais importante em termos de especificidade e sensibilidade para diagnóstico!!
Vocês já ouviram falar no Ensaio de Imunoabsorção enzimática (ELISA – sigla do inglês – Enzyme Linked Immunoassay)?
Esse ensaio está presente em diversos diagnósticos e é tido como um padrão-ouro muitas vezes devido sua interação antígeno-anticorpo (estão lembrados? Temos um post mostrando a importância dos anticorpos, volte, lá!).
Então, vamos lá conceituar…
O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é uma técnica na qual a reação antígeno-anticorpo é verificada por meio da atividade enzimática, desempenhando um papel crucial no âmbito clínico-farmacológico, por apresentar vantagens como: utilização de reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptada tanto a testes simples quanto aos automatizados [1].
Este ensaio pode ser empregado com inúmeros sistemas de detecção, os quais vão de leituras visuais a fotométricas, com substratos coloridos, luminescentes ou fluorescentes, contribuindo assim para a multiplicação de seus métodos e aplicações nas últimas décadas [2].
O princípio básico da reação de ELISA é a imobilização de um dos reagentes em uma fase não líquida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo.
Para que possa ser utilizada em teste de imunoensaio, a enzima deve ser estável, facilmente obtida em forma purificada e possuir conjugação a vários antígenos e anticorpos sem que haja perda de sua atividade. Dentre elas, a mais utilizada é a peroxidase, por possuir os requisitos necessários anteriormente mencionados [2].
Esse teste detecta quantidades extremamente pequenas de anticorpos, podendo ter elevada precisão dos reagentes assim como padronização dos parâmetros. Em relação à peroxidase, o substrato empregado para degradação enzimática é o peróxido de hidrogênio (H2O2), cuja determinação se dá medindo-se a densidade ótica da solução resultante, como também há os cromógenos ou doadores de hidrogênio. Dentre eles, destacam-se o orto-fenilenodiamina (OPD), tetrametilbenzidina (TMB), ortotoluidina, 2,2-diazino do ácido elbenzoazolino sulfônico (ABTS) e ácido 5-aminosalicílico [2, 3].
Estrutura de ELISA
O ELISA é como o próprio nome já diz, um método de imunoensaio composto por um substrato solvente, imuno-reconhecimento e marcador enzimático.
No ELISA de construção, o antígeno ou anticorpo geralmente atua como substrato solvente para se ligar ao material de suporte, então as biomoléculas complementares marcadas com enzima podem se combinar com o solvente formando uma bioconjugação, por último, a geração do sinal de detecção pode ser alcançada pela introdução de reagente cromogênico.
No sistema ELISA, o substrato solvente é a base, o imuno-reconhecimento a estrutura, o marcador enzimático é o transverter de sinal e o reagente cromogênico atua como o sinal de saída, que são chamados de “quatro fundamentos” do ELISA [4].
Principais métodos de ELISA empregados para a pesquisa de anticorpos e antígenos
1. Ensaios para antígenos
A fase sólida é sensibilizada com anticorpo específico. A amostra em teste, onde se vai pesquisar o antígeno, é incubada com a fase sólida e, em seguida incuba-se com excesso de anticorpo específico marcado com a enzima. A reação é revelada pela adição do substrato. A taxa de degradação é proporcional a concentração do antígeno [4].
2. Subtipos de ELISA
- ELISA direto
Nesse método o antígeno será impregnado na placa, onde reagirá com a amostra inserida. O anticorpo é quimicamente marcado por uma enzima e o componente não marcado, nesse caso o antígeno, é ligado a um suporte sólido.
O anticorpo marcado pode se ligar ao antígeno não marcado, sob condição em que a adsorção inespecífica é bloqueada e quaisquer anticorpos não ligados e outras proteínas são retirados por lavagens.
A ligação do anticorpo é medida por uma reação que torna um substrato incolor em um produto colorido. A mudança de cor pode ser lida diretamente na placa onde ocorreu, facilitando a coleta de dados [6, 7].
- ELISA indireto
O ELISA indireto também conhecido por ensaio imunométrico tem como intuito identificar e quantificar os anticorpos contidos na amostra através de ligações com o antígeno adsorvido na fase sólida [5, 6].
O complexo formado pelo antígeno-anticorpo evidencia-se pelo anticorpo secundário, o qual é conjugado com a enzima, seguido do substrato da mesma para produzir cor através do processo oxidativo ou quebra da estrutural entre a enzima e substrato, possibilitando a determinação da concentração do anticorpo primário [7].
Esse tipo de ensaio permite com que haja a identificação dos diversos isotipos de imunoglobulinas como: IgA, IgG, IgM e IgE, além de alótipos como IgG1, IgG2a, IgG3 e igG4 [6].
- ELISA competitivo
No ensaio por competição, o antígeno e o anticorpo podem ser utilizados para o revestimento na fase sólida. A presença de anticorpos será determinada através de uma disputa entre o antígeno e o anticorpo específico.
Para a detecção de anticorpos, o antígeno é previamente incubado com concentrações conhecidas e, ao ser transferido para a placa, não haverá ligação antígeno-anticorpo fixado na fase absortiva, o que ocasiona uma proporção inversa entre a concentração do analito e a intensidade de coloração resultante.
Caso a solução não contiver o antígeno, os anticorpos se ligarão ao fixado na placa [7].
- ELISA sanduíche
O ELISA sanduíche normalmente usa dois tipos de anticorpos, um dos quais atua como um adsorvente, o qual está imobilizado em substrato sólido para capturar antígenos, e outro como anticorpo marcado com enzima que atua como marcador de sinal para identificar o anticorpo primário e, em seguida, catalisa o agente cromogênicos para produzir cor.
Esta estratégia fornece reconhecimento específico conveniente e reduz o custo de preparação de anticorpos marcados com enzima para o antígeno. Além disso, devido à ligação da enzima na região Fc dos anticorpos, o anticorpo secundário marcado com enzima pode reconhecer o anticorpo primário homólogo, o que amplia a aplicação de anticorpos marcados com enzima [4, 7].
Conclusão
O ELISA é conhecido como a técnica mais utilizada em clínicas e hospitais em todo o mundo. Tem sido usado intensamente na indústria de biotecnologia e está se tornando cada vez mais importante nas áreas clínica, de segurança alimentar e ambiental.
Acredita-se que todos os laboratórios utilizaram o ELISA direta ou indiretamente no campo da ciência analítica. Sob operações cuidadosas e corretas, o ELISA pode fornecer dados quantitativos altamente reproduzíveis em pesquisas científicas e diagnósticos clínicos. Quando comparado com outros imunoensaios, o ELISA pode oferecer resultados de detecção relativamente confiáveis, sensíveis e específicos [4, 7].
Além disso, a ideia de que o ELISA pode fornecer novas estratégias de bioimagem e produzir sinal cromogênico, mesmo em células vivas. A especificidade do modelo de acoplamento anticorpo-antígeno torna-se a força de ligação clássica entre as biomoléculas, o que inspira o desenvolvimento de outros sistemas de reconhecimento, como biotina-estreptavidina, de maneira muito específica [4].
No entanto, existem algumas carências comuns do ELISA tradicional se concentram principalmente nos procedimentos tediosos, limite de detecção relativamente baixo e alto volume de amostra. Apesar da alta reprodutibilidade, tais desvantagens podem causar os erros clássicos de ensaio.
Portanto, existem requisitos mais elevados para que os operadores desenvolvam as habilidades necessárias e conduzam o ensaio com cuidado. Além disso, a sensibilidade do ELISA tradicional dificilmente pode atingir o nível de concentração nanomolar, o que não pode atender a demanda da análise de biomarcador em amostras biológicas, principalmente no diagnóstico precoce de doenças [4, 7].
Muito bom conhecer mais um pouquinho, né?
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Até a próxima!
REFERÊNCIAS
[‘] BRGLES, Marija et al. Impact of complement and difference of cell-based assay and ELISA in determination of neutralization capacity against mumps and measles virus. Journal of Immunological Methods, v. 490, p. 112957, 2021.
[2] TABATABAEI, Mahdis Sadat; ISLAM, Rafiq; AHMED, Marya. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-PCR assays: A review. Analytica Chimica Acta, 2020.
[3] CAPUTO, Damiano; CARACCIOLO, Giulio. Nanoparticle-enabled blood tests for early detection of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer letters, v. 470, p. 191-196, 2020.
[4] WU, Long et al. Application of nano-ELISA in food analysis: recent advances and challenges. TrAC Trends in Analytical Chemistry, v. 113, p. 140-156, 2019.
[5] Bender, L.A; Von Mühlen, C.A. Testes Laboratoriais. Aplicados à Imunologia Clínica.Testes sorológicos ou imunoensaios. Capítulo 5; 2018.
[6] PEREIRA, R.L.G. Comparação de técnicas de ensaio de absorção imunoenzimático (ELISA) para avaliação da reatividade de anticorpos anticocaína tipo IgG em camundongos. Dissertação; 2018.
[7] AYDIN, Suleyman. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, v. 72, p. 4-15, 2015.
