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Olá pessoal, tudo bem com vocês?

No post de hoje vamos aprender um pouco sobre antioxidantes, para isso, vamos entender o que são os oxidantes, o que esses tipos de moléculas podem causar no corpo humano, o que é o sistema antioxidante e como ocorre a sua atuação. Além disso, abordaremos alguns dos principais métodos utilizados para medir a atividade antioxidante in vitro.

Vamos lá?

Moléculas oxidantes e seus efeitos no organismo

As moléculas oxidantes que fazem parte do nosso organismo são os radicais livres, que são conhecidos como ROS (espécie reativa de oxigênio) e RNS (espécie reativa de nitrogênio). Esses radicais contêm um ou mais elétrons desemparelhados, o que os tornam altamente reativos. Entre os radicais livres mais conhecidos nesse contexto estão o radical hidroxila (OH), o ânion radical superóxido (O₂), óxido nítrico (NO) e radicais peroxil (ROO). Também existem as espécies não radicais que causam oxidação das moléculas, podendo citar o peróxido de hidrogênio (H₂O₂), oxigênio singlete (O₂), ácido hipocloroso (HOCl) e o peroxinitrito (ONOO) [1].

Apesar de a ROS e a RNS serem vistas como vilões, elas desempenham várias funções fisiológicas importantes no nosso corpo, auxiliando, por exemplo, em várias vias de sinalização celular. No entanto, seus efeitos benéficos em nosso organismo ocorrem quando estão em baixos níveis ou em concentrações moderadas. Quando ocorre uma superprodução de ROS e RNS ou uma concentração elevada dos mesmos, o que se deve a uma deficiência das enzimas antioxidantes ou dos antioxidantes de baixo peso molecular, passam a ter efeitos nocivos para o organismo, gerando assim um estresse oxidativo e danificando as células [1].

Esse estresse oxidativo/nitrosativo é culminado pelo desequilíbrio entre a formação de ROS e RNS e uma deficiência da capacidade de desintoxicação desses reativos ou a incapacidade de restaurar os danos causados ao organismo [1]. Existem alguns marcadores importantes do estresse oxidativo, são eles: os lipídeos peróxidos (LPOs), malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal [2]. A regulação que torna a ROS e a RNS equilibradas e as tornam benéficas para o funcionamento do organismo é mediada por diversos mecanismos que são denominados de regulação redox [1].

As espécies reativas de oxigênio, quando em grandes concentrações, atacam as moléculas do sistema biológico, danificando-as e assim culminado em vários distúrbios fisiológicos, podendo gerar doenças. O estresse oxidativo pode desempenhar um papel de grande importância em muitas doenças, entre elas: hipertensão, diabetes mellitus, aterosclerose, doença isquêmica e até mesmo câncer, que é uma das mais associadas ao estresse oxidativo [2].

A ROS pode iniciar um câncer ou contribuir para a progressão do mesmo, pois as células cancerosas promovem um aumento na formação da ROS e RNS, isso se dá por conta das alterações metabólicas e na interferência na sinalização entre células que essas células cancerosas causam, esse aumento nos reativos é contrabalançado por defesa antioxidante aprimorada. As células cancerosas tem a capacidade de se adaptar a um desequilíbrio redox, através da regulação dos seus sistemas de defesa antioxidante, os tornando-as, assim, insensíveis a outros indutores de estresse, como por exemplo a quimioterapia [1].

As espécies reativas de oxigênio também podem danificar os ácidos nucléicos, podendo causar a reticulação da molécula de DNA, alterar a estrutura das bases, quebrar a fita, e consequentemente gerar mutações. Isso ocorre porque a ROS tem a capacidade de oxidar tanto a espinha dorsal, quanto a cadeia lateral das proteínas. Elas interagem com as cadeias laterais de aminoácido gerando carbonil [3].Apesar de ser preocupante a oxidação das proteínas, principalmente quando se trata do DNA, a oxidação principalmente em lipídeos, a exemplo de ácidos graxos poli-insaturados. Por exemplo, a oxidação do ácido araquidônico e ácido docosahexaenóico resulta em malondialdeído e 4-hidroxinonenal, que estão entre os mais comuns decaimentos oxidativos dos lipídeos. Essa oxidação lipídica é prejudicial à membrana das células, podendo resultar na morte celular [3].

Como os radicais livres são produzidos?

Os radicais livres podem ser produzidos através de fontes endógenas e/ou exógenas. Uma das fontes endógenas que podemos citar são as enzimas da cadeia respiratória da mitocôndria, sendo elas NADPH oxidase, xantina oxidase (XO) e disfunção endotelial NOS (eNOS), ainda podemos citar os metais redox ativos livres, que são o ferro e o cobre, os quais podem gerar radicais livres por meio da decomposição catalítica de peróxido de hidrogênio [1]. Entre as fontes exógenas são os poluentes e toxinas como: a fumaça do cigarro, radiação UV, radiação ionizante, álcool, pesticidas, entre outros [3].

Na respiração aeróbica, a qual utiliza oxigênio para oxidar o carbono e biomoléculas que contém hidrogênio com o objetivo de produzir calor e energia química, o oxigênio é reduzido em diversas espécies intermediárias de forma gradativa, produzindo assim moléculas como o ânion radical superóxido, o radical hidroperoxil, o peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e ânion hidroxila [3].

A cadeia transportadora de elétrons, encontrada nas mitocôndrias, é a principal produtora de radicais livres. Cerca de 85% do O₂ consumido nas mitocôndrias é metabolizado através da respiração aeróbica. Nesse processo, o O₂ vai sofrer uma redução tretavalente (aceitação de 4 elétrons), que resulta da formação de H₂O (água) e energia. O citocromo oxidase é a enzima responsável por essa reação, ela age na parte terminal da cadeia transportadora de elétrons, oxidando quatro moléculas de citocromo c através da remoção de um elétron de cada um deles. Quando esses elétrons são capturados, são adicionados ao O₂ e assim se forma a água e, consequentemente, essa reação gera energia. A enzima citada acima também é responsável por controlar a geração dos radicais livres nesse processo, impedindo que sejam gerados de forma excessiva [5].

Agora que já sabemos o que são os radicais livres e como eles podem ser gerados, iremos abordar sobre a neutralização deles, que se dá através de substâncias ou compostos que são chamadas de antioxidantes, vamos conhecer um pouco mais sobre eles?

O sistema antioxidante e sua atuação nas moléculas oxidantes

O sistema antioxidante atua como um sistema de defesa do organismo, que age inibindo ou reduzindo danos ocasionados pela ação dos radicais livres. Essa função de proteção, pode ser exercida através de vários mecanismos, como por exemplo, impossibilitando a formação e ação de radicais livres ou restaurando e reparando a ação destes em tecidos lesionados [5]. Esse sistema vai auxiliar na redução do estresse oxidativo, nas mutações do DNA que podem ser causadas pelos radicais livres, redução dos danos celulares, entre outros problemas que podem ser causados pelas espécies reativas, consequentemente reduzem a incidência de doenças degenerativas, como o câncer [3].O mecanismo de ação antioxidante pode ser exercido através de três tipos de sistemas: os sistemas de prevenção, impedindo a formação dos radicais livres e ou espécies não radicais; os sistemas varredores, impedindo a ação dos radicais livres e das espécies não radicais; e os sistemas de reparo, auxiliando na reconstituição das estruturas que foram lesionadas pela ação dos radicais [5].

O sistema antioxidante é comumente dividido em sistema enzimático e não enzimático. O sistema enzimático é executado através da ação das enzimas como, catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), sendo estas, atuantes no mecanismo de prevenção, controlando ou inibindo tanto a formação de radicais livres quanto de espécies não-radicais. Já o sistema não enzimático é composto por substâncias antioxidantes oriundas da dieta, como por exemplo o ácido ascórbico, α-tocoferol e β-caroteno [5].

Quando presentes em concentrações adequadas, as substâncias antioxidantes são capazes de inibir ou retardar de forma eficaz a oxidação de um substrato oxidável [5]. Com o envelhecimento, o estresse oxidativo vai ficando mais agudo, pois as substâncias antioxidantes endógenas e o sistema de reparo não são mais tão eficazes na neutralização dos radicais livres. Para suprir essa deficiência, deve-se reforçar ainda mais a obtenção de antioxidantes através da dieta [3].

Antioxidantes a partir de plantas

Sabe-se que as plantas produzem uma grande variedade de substâncias com atividade antioxidante. Essas substâncias são normalmente metabólitos secundários que atuam na defesa da planta contra o estresse abiótico, além de ter outras funções. Os principais metabólitos secundários encontrados nas plantas são os compostos fenólicos, cuja presença é influenciada por diversos fatores como, espécie da planta e condições de cultivo (temperatura, índice de de chuvas, exposição solar, altitude, irrigação etc.).

Dentre os compostos fenólicos mais relatados na literatura por apresentar atividade antioxidante, podemos citar o resveratrol, a catequina, a quercetina e o ácido gálico. Outros classes de compostos como o β-caroteno, o ácido ascórbico, o α-tocoferol e o licopeno também são reconhecidos por apresentar essa propriedade [5].Esses antioxidantes exógenos podem atuar auxiliando no retardamento dos antioxidantes endógenos, assim estas moléculas permanecem em maior tempo no organismo e consequentemente atuam por mais tempo, podendo melhorar a capacidade de contenção das espécies reativas [3]. Diversos estudos têm tentado entender os mecanismos de ação dos antioxidantes exógenos e têm relatado que a característica antioxidante dos mesmos está relacionada à capacidade de sequestro de radicais livres, à redução da peroxidação lipídica e ao aumento da produção de enzimas com propriedades antioxidantes [6]. As conclusões científicas reforçam a importância da alimentação rica em vegetais para prevenção de doenças e mostram o potencial de extratos naturais para aplicação terapêutica.

Para avaliar a capacidade de extratos ou compostos específicos de neutralização de radicais livres, existem alguns ensaios feitos in vitro, vamos conferir?

Métodos mais usados para avaliar atividade antioxidante in vitro

Método DPPH: DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) é uma molécula de coloração violeta, que tem como característica ser um radical livre estável, devido a deslocalização do elétron desemparelhado por toda a molécula. O método de avaliação de atividade antioxidante com DPPH é baseado na capacidade de um composto de sequestrar o radical DPPH, fazendo assim com que ele seja reduzido a hidrazina. Quando ocorre essa redução, ocorre uma mudança simultânea na coloração do radical, passando de violeta para amarelo pálido. O método de controle desse método é através da absorbância no comprimento de onda que é observado entre 515 e 528 nm [8].

Método ABTS: O radical ABTS•+ (ácido 2,2′-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico) é formado através de uma reação química com o persulfato de potássio, com uma relação estequiométrica de 1:0,5. Após a sua formação, é diluído em etanol até alcançar uma absorbância de 0,70 (± 0,02) a um comprimento de onda de 754 nm e com temperatura equilibrada em 30 °C [9]. É um método muito utilizado para medir a atividade antioxidante total de soluções de substâncias puras, misturas aquosas e bebidas. Ele é baseado na ativação da metamioglobulina com peróxido de hidrogênio, que quando presente o ABTS, produz o cátion radical, seja na ausência ou presença de antioxidantes. A adição de um antioxidante reduzirá o ABTS, sendo o tempo de análise dependente da atividade antioxidante, da concentração desse antioxidante e da duração da reação. Assim, a porcentagem de inibição através da coloração se dá em função da concentração e do tempo e é calculado em relação à reatividade do Trolox como padrão [10].

Estudos para obtenção e aplicação de antioxidantes oriundos de plantas tem sido largamente desenvolvidos, principalmente in vitro, com o objetivo de criar estratégias para auxiliar no processo de neutralização de radicais livres do organismo humano e por fim, prevenir doenças. Nesse contexto, os conceitos relacionados aos antioxidantes, os mecanismos envolvidos e suas propriedades devem ser continuamente estudados e atualizados para que esses compostos naturais sejam cada vez mais utilizados em produtos como fármacos, cosméticos e aditivos alimentícios.

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Referências

1. POPRAC, Patrik et al. Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases. Trends in pharmacological sciences, v. 38, n. 7, p. 592-607, 2017.
2. WU, Qinghua et al. The antioxidant, immunomodulatory, and anti-inflammatory activities of Spirulina: an overview. Archives of toxicology, v. 90, n. 8, p. 1817-1840, 2016.
3. PISOSCHI, Aurelia Magdalena; POP, Aneta. The role of antioxidants in the chemistry of oxidative stress: A review. European journal of medicinal chemistry, v. 97, p. 55-74, 2015.
4. What are free radicals, anyway? https://solesence.com/what-are-free-radicals-anyway/
5. BARBOSA, Kiriaque Barra Ferreira et al. Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Revista de nutrição, v. 23, n. 4, p. 629-643, 2010.
6. GOMES, Débora Cássia Vieira et al. Antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic/antitumoral bioactives from the phylum Basidiomycota and their possible mechanisms of action. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 112, p. 108643, 2019.
7. SEIFU, D., F. ASSEFA AND S. ABAY. “Medicinal plants as antioxidant agents : Understanding their mechanism of action and therapeutic efficacy.” 2013. Disponível em: https://www.semanticscholar.org/paper/Medicinal-plants-as-antioxidant-agents-%3A-their-of-Seifu-Assefa/1d903523f1f990e759b15406729a8aca02a89185
8. ALVES, Clayton Q. et al. Métodos para determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos. Química Nova, v. 33, n. 10, p. 2202-2210, 2010.
9. FREITAS, GL de et al. Avaliação da atividade antioxidante de diferentes cervejas aplicando os métodos ABTS e DPPH. Alimentos e Nutrição Araraquara, v. 17, n. 3, p. 303-307, 2009.
10. RE, Roberta et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology and medicine, v. 26, n. 9-10, p. 1231-1237, 1999.
11. ÜSTÜNDAŞ, M., YENER, H., HELVACI, Ş. Parameters affecting lycopene extraction from tomato powder and its antioxidant activity. Anadolu University Journal of Science and Technology-A Applied Sciences and Engineering. 1-1. 2018. 10.18038/aubtda.363140.